Стадии апоптоза клеток. Апоптоз - запрограммированная клеточная смерть. Молекулярные механизмы апоптоза клетки
С философских позиций, отстаиваемых многими мыслителями, глубоко разрабатывавшими диалектику природы, любое «явление» материального мира имеет свое зеркальное отражение в виде «антиявления». По существу составляющих его элементов это «антиявление» может мало чем отличаться от своего антипода (природа «экономит» свои силы и ресурсы).
Однако самое главное его отличие состоит в диаметрально противоположной направленности процесса, конечным результатом которого будет полная противоположность исходному состоянию.
В этом плане апоптоз есть запрограммированная нормальная гибель клетки, в механизме которой ключевую роль играют специальные и генетически детерминируемые внутриклеточные изменения.
В данном определении, пожалуй, все понятно, кроме понятия «нормальной гибели». Кстати, «апоптоз» с греческого переводится как «опадание листьев». (Пожалуй, читатель согласится, что более точную метафору этому феномену подобрать было бы трудно.)
Но разве гибель живой нормальной клетки может быть нормальной? Оказывается, да, может, поскольку этим определяется постоянство внутренней клеточной среды организма, обеспечивающее его существование (любая клетка недолговечна и требует замены ), и, по-видимому, смена клеточного состава обеспечивает в ближайшей перспективе приспособление организма к меняющимся условиям среды, а в отдаленной, может быть, играет важную роль в эволюции вида.
Пример
Довольно ярким примером апоптоза могут служить физиологические изменения в женской репродуктивной системе, обеспечивающие нормальную репродуктивную функцию:
– гибель клеток (ооцита и фолликулярных клеток ) атрезирующих фолликулов;
– гибель клеток редуцирующегося желтого тела;
– гибель клеток функционального слоя эндометрия накануне менструации;
– гибель лактоцитов молочной железы после прекращения лактации и т. д.
Причины феномена
После краткого философского осмысления феномена «апоптоза» можно перейти к точным биологически доказанным причинам феномена запрограммированной гибели клетки. Их две.
- Скрытые «поломки» самой клетки в ходе клеточного цикла.
Здесь прежде всего речь идет о поломках, возникающих в самой клетке: повреждение хромосом (чаще всего это разрывы ДНК ).
Другой, не менее редкой причиной могут стать и повреждения митохондрий (чаще всего токсическое или лучевое чрезмерное влияния ). Здесь важно отметить, что повреждение клеточных структур, ведущее к апоптозу, хотя и должно быть сильным, но оно не может быть чрезвычайно сильным, так как у клетки должны сохраняться резервы для физиологической экспрессии генов апоптоза.
Если повреждения клетки чрезмерны , процесс ее гибели становится неуправляемым и представляет собой уже некроз.
- Сигнализация «на уничтожение», идущая снаружи через специальные рецепторы клетки. Или, иначе, внешние сигналы, обусловливающие апоптоз. Здесь следует отметить большой спектр физиологических процессов, которые можно с полным основанием отнести к апоптозу которые участвуют в процессе онтогенеза.
Разумеется, объем данной статьи не позволяет рассматривать подробно все молекулярные основы апоптоза, но о некоторых «ключевых» факторах невозможно не упомянуть. Так, например, фолликулы яичников выделяют белковый фактор «гонадокринин », который тормозит развитие других фолликулов (т. е. гонадокринин здесь уже играет роль физиологического «регулятора» численности популяции клеток, готовых вступить в стадию созревания).
Апоптоз как антипролиферативный фактор , завершающий биологический цикл клетки ее гибелью, - по существу, инструмент, с помощью которого решаются многие проблемы, которые не касаются «напрямую» жизненного цикла клетки.
Другой интересный факт : апоптоз клетки, продиктованный событиями, лежащими вне клетки, касается только делящихся клеток, поэтому в таких случаях апоптоз является одним из эффективных способов физиологической (нормальной) регуляции численности клеточной популяции.
Пусковые факторы
Пусковыми факторами апоптоза могут являться прекращение действия положительного сигнала, поддерживающего ритм клеточного цикла, например гибель клеток функционального слоя эндометрия из-за спада уровней половых гормонов. Другим примером может быть возрастание содержания белка р53, которое наблюдается из-за отсутствия опоры эпителиального пласта на базальную мембрану.
Во многих вариантах природа внешнего сигнала, начинающего или прекращающего действовать на клетку, весьма разнообразна. К этим факторам можно отнести гормоны, гистогормоны (цитокины), антиген, белок з53 и фактор некроза опухолей.
Морфология
Морфология апоптоза хорошо изучена и довольно последовательна в своем развитии. Этот феномен привлекает особое внимание при сравнении его с механизмами клеточной пролиферации.
Следует заметить, что, раз начавшись, процесс почти не зависит от вида пусковых факторов, и один этап переходит в другой. Все начинается с конденсации хроматина ядра клетки и ее цитоплазмы. В результате ядро становится фрагментарным, а цитоплазма, уменьшаясь в объеме, изменяет форму клетки.
Следующим этапом апоптоза будет фрагментация ядра и цитоплазмы с образованием апоптозных телец. Ядро распадется на отдельные фрагменты, окруженные ядерной оболочкой. Эти фрагменты содержат очень плотные массы хроматина. В конце этого процесса апоптозные тельца отшнуровываются. В некоторых из телец оказываются ядерные фрагменты, в других - только цитоплазматическое содержимое. Но те и другие окружены плазмолеммой с несколько измененным составом. А дальше происходит то, что происходит уже с телами, ставшими инородными для организма: фагоцитоз апоптозных телец окружающими клетками (фагоцитами, нейтрофилами и др.).
Фагоцитированные ими тельца быстро разрушаются в фаголизосомах.
Благодаря сохранению плазмолеммы у апоптозных телец и их быстрому фагоцитозу, содержимое погибшей клетки не попадает в межклеточную среду и реакции воспаления не возникает.
Следует отметить, что все стадии апоптоза совершаются довольно быстро (за несколько часов). Именно поэтому при микроскопии выявить клетки, находящиеся в процессе апоптоза, довольно трудно.
Противоположность
В противоположность апоптозу , при некрозе морфологическая картина иная, так как происходит сильное повреждение клетки (например, прекращение кровотока). При этих условиях механизмы апоптоза сработать не могут, да и морфологическая картина, как нетрудно убедиться, совсем иная. Это, прежде всего, повреждение плазмолеммы, набухание клетки, ядра и других мембранных структур. Таким образом, при некрозе объем клетки увеличивается, а при апоптозе - уменьшается. Хроматин ядра меняется не сразу, а к середине или к концу процесса.
Вначале он конденсируется у ядерной мембраны. Затем в результате кариолиза хроматин исчезает (тогда как при апоптозе фрагменты хроматина оказываются в апоптозных тельцах). В последующем отмечаются разрыв плазмолеммы и высвобождение продуктов клеточного распада в межклеточную среду.
Последние вызывают повреждение соседних клеток (в которых начинаются процессы апоптоза или некроза), и главное - начало процесса воспаления.
Следует сказать, что весь процесс некроза клетки может завершаться очень быстро, например за 1 час. Но его последствия столь значительны, что световая микроскопия выявляет чаще некроз, чем апоптоз.
В отличие от некроза, который представляется грубым «инструментом» уничтожения клетки, апоптоз выглядит более изящным, «цивилизованным» способом самоубийства, заранее запрограммированным, и потому выбор смертоносных воздействий представлен «точечными» ударами физиологических факторов.
Для этой цели существует довольно разнообразный «джентльменский набор», действующий последовательно, как по команде, и, надо сказать, почти безотказно.
Инструменты апофоза
Одним из важнейших инструментов апоптоза является специальное семейство цитоплазматических протеаз, или так называемых каспаз . По структуре они относятся к сериновым протеазам по наличию в активном центре остатка - аминокислоты серина.
В своих белковых мишенях каспазы разрывают пептидные связи, образованные с участием остатка аспарагиновой кислоты. Всего в семействе каспаз 10 ферментов, поэтому каспазы способны в определенной последовательности активировать друг друга, образуя своего рода «каскад», причем разветвленный. С учетом этой разветвленной структуры каспаз, не вдаваясь в подробности ее структуры, которая достаточно сложна и во многом еще не выяснена, можно видеть, что главная их функция состоит в избирательном и ограниченном протеолизе определенных белковых мишеней (в основном ядерных белков), без затраты значительных количеств энергии.
В хорошо настроенном «оркестре» апоптоза (во многом благодаря предсуществующей генетической запрограммированности феномена на самоуничтожение клетки), в котором роль «первой скрипки» исполняет семейство цитоплазматических протеаз - каспаз, слажено «звучат» и другие факторы, такие как, например, эндонуклеазы, которые рассматриваются вторым по важности (после каспаз) «инструментом» апоптоза.
Не вдаваясь в детали этой довольно сложной и во многом еще не понятной последовательности событий, здесь для нашей задачи целостного рассмотрения феноменов клеточной пролиферации и апоптоза следует указать на преимущественно ядерную локализацию эндонуклеаз .
Эти белки-ферменты обладают двумя важными свойствами . Во-первых, эндонуклеазы в отличие от других ферментов, осуществляющих аутолиз ДНК, расщепляют ДНК хромосом не в случайных местах, а только в линкерных участках. Поэтому хроматин не подвергается полному лизису, а лишь фрагментируется, что составляет отличительную черту апоптоза.
И наконец, последнее, но не менее важное . Речь идет о белке р53, который рассматривается как универсальный фактор, тормозящий клеточную пролиферацию, а при определенных условиях и опухолевую трансформацию. В ходе многих, если не всех видов апоптоза в клетках возрастают содержание и активность белка р53. Дело в том, что белок р53 стимулирует гены ряда «киллерных» рецепторов, т. е. рецепторов, воспринимающих «команду» начала апоптоза. Среди них белки Fas-рецептор и рецептор KILLER/DR5. Таким путем повышается чувствительность клетки к сигналам, запускающим апоптоз.
Другой важной функцией белка р53 является его способность останавливать клеточный цикл. Это происходит благодаря активации гена Р21, продукт которого (белок р21) ингибирует известные уже нам комплексы циклинов (циклин-Cdks).
Очень важно иметь в виду воздействие белка р53 и на окружающие клетки . Белок р53 активирует и такие гены, продукты которых выделяются из гибнущей клетки и воздействуют на ее окружение, например подавление ангиогенеза (торможение опухолевого роста), и, что особенно важно в свете рассматриваемой проблемы, р53 действует как фактор, стимулирующий синтез и секрецию ряда ингибиторов пролиферации клеток.
Даже из далеко не полного списка функций белка р53 видно, что этот фактор исполняет роль «первой скрипки» в слаженном звучании оркестра «ферментов-исполнителей» и внимательно следит за «хромосомным дирижером», с тем чтобы не пропустить такт своего вступления, или наоборот, выдержать необходимую паузу.
Апоптоз — это генетически регулируемая программа клеточной гибели, которая имеет определенные морфологические критерии и биохимические маркеры. Эта программа очень важна для нормального развития многоклеточного орга-низма, сохранения нормального числа полноценных и своевременного удале-ния поврежденных клеток.
Термин «апоптоз» (гр. аро — полное, ptosis — падение, утрата) предложил в 1972 году J. F. Kerr, заимствовав его у Гиппократа, назвавшего так осенний листопад.
Известно, что действие сильных повреждающих факторов вызывает некроз клетки. Гибель клетки в этом случае обусловлена избыточной внешней энер-гией (физической, химической или биологической), нарушающей ее внут-риклеточный энергетический баланс и приводящей к потере структурной целостности.
В последние годы растет интерес к запрограммированной гибели клеток — апоптозу. Важно понимать, что фактор, вызывающий апоп-тоз, не обладает достаточной энергией для непосредственного повреждения клетки. Он лишь включает ее собственные механизмы самоуничтожения, т.е. апоптоз реализуется за счет внутренней энергии клетки и является таким же неотъемлемым свойством живого, как рост, пролиферация и размножение.
Возможности регуляции клеточной жизни всегда вызывали большой ин-терес биологов и врачей. Если процессы пролиферации являются достаточно изученными, то точка зрения на регуляцию разрушения (умирания) клеток пока еще не оформлена в окончательном виде в то же время при многих со-стояниях нарушения именно этой программы становятся определяющими для течения заболевания.
Апоптоз имеет четко выраженные и довольно хорошо изученные морфоло-гические критерии: уменьшение размеров, сморщивание клетки, конденсация и фрагментация ядра, разрушение цитоскелета при сохранении целостности клеточной мембраны .
Апоптотические тельца
Когда процесс внутренней деградации завершен, клетка представляет собой совокупность фрагментов цитоплазмы, окруженных мембранами (т. н. апоптотические тельца). Изоляция внутриклеточного содержимого элементами цито-леммы является главной причиной отсутствия асептического воспаления при апоптозе. Таким образом, гибель клетки путем апоптоза (в отличие от некроти-ческой) переносится организмом относительно «безболезненно». В последую-щем апоптотические тельца фагоцитируются макрофагами , где макромолеку-лы погибшей клетки расщепляются до мономеров.
Сегодня установлено множество факторов, способных индуцировать апо-птоз клетки. С другой стороны, некоторые воздействия могут повысить устой-чивость к запрограммированной гибели (табл. 1).
| I. Ингибиторы апоптоза |
| Физиологические ингибиторы |
|
| Гены вирусов |
|
| Фармакологические агенты |
|
| II. Индукторы апоптоза |
| Физиологические активаторы |
|
| Агенты, вызывающие повреждение |
|
| Агенты, связанные с лечением каких-либо заболеваний |
|
| Токсины |
|
Эффекторный механизм иммунных реакций
Регуляция иммунного ответа
Апоптоз иммунокомпетентных клеток является неотъемлемым компонен-том иммунных реакций. Установлено, что селекция антигенспецифических Т- и В-лимфоцитов сопровождается массовой гибелью активированных, но антигеннеспецифических лимфоцитов. С другой стороны, результатом иммун-ного ответа является накопление избыточного количества антигенспецифических Т- и В-клеток, что ведет к нарушению генетически детерминированного баланса клеток макроорганизма. Выравнивание клеточного баланса после уда-ления патогена обусловлено именно запрограммированной гибелью большей части антигенспецифических лимфоцитов.
Цитоплазматический апоптоз
Как уже указывалось, апоптоз является внутренним свойством клетки, свое-образной ее реакцией на различные внешние раздражители. Поэтому неуди-вительно, что в любой клетке человеческого организма функционирует целая система цитоплазматического апоптоза (рис. 32), Информация о структуре компонентов этой систе-мы содержится в геноме и передается от поколения к поколению. Указанную систему цитоплазматического апоптоза условно можно разделить на три части. Первая — это совокупность мембранных рецепторов, способных воспринимать проапоптотические сигналы из внутренней среды организма. Вторая — это комплекс цитоплазматических посредников, передающих воспринятый рецептором сигнал внутрь клетки к эффекторному звену. Третья — это эффекторное звено апоптоза, т.е. те компонен-ты, активация которых приводит к непосредственной гибели клетки.
Рецепторы апоптоза
Сегодня открыт целый ряд рецепторов, воспринимающих проапоптотические сигналы. Это Fas (CD95), TNF-R1 (рецептор 1-го типа к ФНО-α), DR3 (WS1-1), DR4 (TRAIL-рецептор 1), DR5 (1 RAIL-рецептор 2), DR6. Хотя указанные ре-цепторы приводят к одному и тому же биологическому эффекту, они относятся к разным семействам и поэтому отличаются по структуре. Так, Fas и TNF-R при-надлежат к семейству рецепторов к ФF10, а молекулы DR — к антигенам гис-тосовместимости. Общность их биологического действия обусловлена природой молекул, связанных с цитоплазматической частью рецептора. Такие молекулы по-лучили название доменов смерти Именно они и приводят к активации апоптоза. Наиболее изученными доменами смерти являются молекулы FADD и TRADD.
Ферменты апоптоза
Цитоплазматическими посредниками в системе апоптоза являются специ-альные ферменты, каспазы. Каспазы способны к последовательной активации друг друга, поэтому образуют своеобразный внутриклеточный каскад, включа-емый доменами смерти. Домены смерти находятся на внутренней поверхнос-ти цитолеммы в неактивном состоянии. При активации рецептора, с которым функционально связан тот или иной домен, происходит изменение конформа-ции обеих структур. Вследствие этого высвобождается активный центр домена, и он приобретает возможность взаимодействовать с каспазой 8 — инициатором всего каспазного каскада. Конечным компонентом этого каскада является каспаза 7. Именно этот фермент активирует латентную эндонуклеазу, оказывающую непосредственный повреждающий эффект на генетический материал клетки (разрывает ДНК в межнуклеосомных участках). Таким образом, эффекторным звеном системы апоптоза является латентная эндонуклеаза.
Митохондриальный апоптоз
Кроме цитоплазматических, в клетке содержится ком-плекс митохондриальных посредников апоптоза. Известно, что разрушение митохондриального аппарата приводит к неминуемой гибели клетки, посколь-ку последняя лишена энергетического обеспечения Для предотвращения не-кроза при повреждении митохондрий активируются указанные белки, обус-лавливающие более экономную апоптотическую гибель нежизнеспособной клетки. Таким образом, каскад апоптоза может реализовываться как по цито-плазматическому, так и по митохондриальному пути.
На этой странице материал по темам:
Апоптоз – это программированная клеточная смерть (инициирующаяся под действием вне- или внутриклеточных факторов) в развитии которой активную роль принимают специальные и генетически запрограммированные внутриклеточные механизмы . Он, в отличие от некроза активный процесс, требующий определенных энергозатрат . Первоначально пытались разграничить понятия «программированная клеточная гибель » и «апоптоз »: к первому термину относили устранение клеток в эмбриогенезе, а ко второму – программированную смерть только зрелых дифференцированных клеток. В настоящее время выяснилось, что никакой целесообразности в этом нет (механизмы развития клеточной гибели одинаковы) и два понятия превратились в синонимы, хотя это объединение и не бесспорно.
Прежде чем приступить к изложению материала о роли апоптоза для жизнедеятельности клетки (и организма) в норме и патологии, мы рассмотрим механизм апоптоза. Их реализацию можно представить в виде поэтапного развития следующих стадий:
1 стадия – стадия инициации (индукции) .
В зависимости от происхождения сигнала, стимулирующего апоптоз, различают:
внутриклеточные стимулы апоптоза . Среди них к наиболее известным относят – разные виды облучения, избыток Н + , оксид азота, свободные радикалы кислорода и липидов, гипертермия и др. Все они могут вызывать различные повреждения хромосом (разрывы ДНК, нарушения ее конформации др.) и внутриклеточных мембран (особенно митохондрий). То есть в данном случае поводом для апоптоза служит «неудовлетворительное состояние самой клетки» (Мушкамбиров Н.П., Кузнецов С.Л., 2003). Причем, повреждение структур клеток должно быть достаточно сильным, но не разрушительным. У клетки должны сохраниться энергетические и материальные ресурсы для активации генов апоптоза и его эффекторных механизмов. Внутриклеточный путь стимуляции программированной смерти клетки можно обозначить как «апоптоз изнутри »;
трансмембранные стимулы апоптоза , т.е., в этом случае он активируется внешней «сигнализацией», которая передается через мембранные или (реже) внутриклеточные рецепторы. Клетка может быть вполне жизнеспособной, но, с позиции целостного организма или «ошибочной» стимуляции апоптоза, она должна погибнуть. Этот вариант апоптоза получил название «апоптоз по команде ».
Трансмембранные стимулы подразделяются на:
«отрицательные » сигналы. Для нормальной жизнедеятельности клетки, регуляции ее деления и размножения необходимо воздействие на нее через рецепторы различных БАВ: факторов роста, цитокинов, гормонов. Среди прочих эффектов, они подавляют механизмы клеточной гибели. И естественно, дефицит или отсутствие данных БАВ активирует механизмы программированной смерти клетки;
«положительные » сигналы. Сигнальные молекулы, такие как ФНОα, глюкокортикоиды, некоторые антигены, адгезивные белки и др., после взаимодействия с клеточными рецепторами могут запускать программу апоптоза.
На клеточных мембранах находится группа рецепторов, в задачу которых передача сигнала к развитию апоптоза является основной, возможно даже единственной функцией. Это, например, белки группы DR (death receptos – «рецепторы смерти »): DR 3 , DR 4 , DR 5 . Наиболее хорошо изучен Fas-рецептор, появляющийся на поверхности клеток (гепатоцитах) спонтанно или под влиянием активации (зрелые лимфоциты). Fas-рецептор при взаимодействии с Fas-рецептором (лигандом) Т-киллера запускает программу смерти клетки мишени. Однако, взаимодействие Fas-рецептора с Fas-лигандом в областях, изолированных от иммунной системы, заканчивается гибелью самого Т-киллера (см. нижеигандом в областях, изолированных от иммунной системы, заканчивается гибелью самого Т-киллера ()ожно000000000000000000000000000).
Следует помнить, что некоторые сигнальные молекулы апоптоза, в зависимости от ситуации могут наоборот, блокировать развитие программированной смерти клеток. Амбивалентность (двойственное проявление противоположных качеств) характерна для ФНО, ИЛ-2, интерферона γ и др.
На мембранах эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, а так же клеток легкого и кожи обнаружены особые антигены-маркеры . На них синтезируются физиологические аутоантитела , и они, выполняя роль опсонинов , способствуют фагоцитозу этих клеток, т.е. гибель клеток происходит путемаутофагоцитоза . Выяснилось, что антигены-маркеры появляются на поверхности «старых» (прошедших свой путь онтогенетического развития) и поврежденных клетках, молодые и неповрежденные клетки их не имеют. Данные антигены получили название «антигены-маркеры стареющих и поврежденных клеток» или «белок третьей полосы». Появление белка третьей полосы контролируется геномом клетки. Следовательно, аутофагоцитоз можно рассматривать, как вариант запрограммированной гибели клеток .
Смешанные сигналы. Это сочетанное воздействие сигналов первой и второй группы. Например, апоптоз происходит с лимфоцитами, активированных митогоном (положительный сигнал), но не вступивших в контакт с АГ (отрицательный сигнал).
2 стадия – стадия программирования (контроля и интеграции механизмов апоптоза).
Для этой стадии характерно два, диаметрально противоположных процесса, наблюдающихся после инициации. Происходит либо:
реализация пускового сигнала к апоптозу через активацию его программы (эффекторами являются каспазы и эндонуклеазы);
блокируется эффект пускового сигнала апоптоза.
Различают два основных, но не исключающих друг друга, варианта исполнения стадии программирования (рис. 14):
Рис. 14. Каспазный каскад и его мишени
R– мембранный рецептор; К – каспазы;AIF– митохондриальная протеаза; Цит. С – цитохром с;Apaf-1 – цитоплазматический белок;IAPs– ингибиторы каспаз
1. Прямая передача сигнала (прямой путь активации эффекторных механизмов апоптоза минуя геном клетки) реализуется через:
адапторные белки. Например, так осуществляется запуск апоптоза Т-киллером. Он активирует каспазу-8 (адапторный белок). Аналогично может действовать и ФНО;
цитохром С и протеазу ΑIF (митохондриальная протеаза). Они выходят из поврежденной митохондрии и активируют каспазу-9;
гранзимы. Т-киллеры синтезируют белок перфорин, который образует каналы в плазмолемме клетки-мишени. Через эти каналы в клетку проникают протеолитические ферменты гранзимы , выделяемые все тем же Т-киллером и они запускают каскад каспазной сети.
2. Опосредованная передача сигнала. Она реализуется с помощью генома клетки путем:
репрессии генов, контролирующих синтез белков-ингибиторов апоптоза (гены Bcl-2, Bcl-XL и др). Белки Bcl-2 в нормальных клетках входят в состав мембраны митохондрий и закрывают каналы по которым из этих органоидов выходят цитохром С и протеаза AIF;
экспрессии, активации генов, контролирующих синтез белков-активаторов апоптоза (гены Bax, Bad, Bak, Rb, P 53 и др.). Они, в свою очередь активируют каспазы (к-8, к-9).
На рис. 14 представлена примерная схема каспазного принципа активации каспаз. Видно, что откуда бы не запускался каскад, его узловым моментом является каспаза 3. Она активируется и каспазой 8 и 9. Всего в семействе каспаз – более 10 ферментов. Локализуются в цитоплазме клетки в неактивном состоянии (прокаспазы). Положение всех каспаз в данном каскаде до конца не выяснено, поэтому на схеме ряд из них отсутствует. Как только активируются каспазы 3,7,6 (возможно и их другие типы) наступает 3 стадия апоптоза.
3 стадия – стадия реализация программы (исполнительная, эффекторная).
Непосредственными исполнителями («палачами» клетки) являются выше указанные каспазы и эндонуклеазы. Местом приложения их действия (протеолиза) служат (рис. 14):
цитоплазматические белки – белки цитоскелета (фодрин и актин). Гидролизом фодрина объясняют изменение поверхности клетки – «гофрирование» плазмолеммы (появление на ней впячиваний и выступов);
белки некоторых цитоплазматических регуляторных ферментов: фосфолипазы А 2 , протеинкиназы С и др.;
ядерные белки. Протеолиз ядерных белков занимает основное место в развитии апоптоза. Разрушаются структурные белки, белки ферментов репликации и репарации (ДНК-протеинкиназы и др.), регуляторные белки (рRb и др.), белки-ингибиторов эндонуклеаз.
Иннактивация последней группы – белков ингибиторов эндонуклеаз приводит к активации эндонуклеаз, второму « орудию » апоптоза . В настоящее время эндонуклеазы и в частности, Са 2+ , Мg 2+ -зависимая эндонуклеаза , рассматривается как центральный фермент программируемой смерти клетки. Она расщепляет ДНК не в случайных местах, а только в линкерных участках (соединительные участки между нуклеосомами). Поэтому хроматин не лизируется, а только фрагментируется, что определяет отличительную, структурную черту апоптоза.
Вследствие разрушения белка и хроматина в клетке формируются и от нее отпочковываются различные фрагменты – апоптозные тельца. В них находятся остатки цитоплазмы, органелл, хроматина и др.
4 стадия – стадия удаления апоптозных телец (фрагментов клетки).
На поверхности апоптозных телец экспрессируются лиганды, они распознаются рецепторами фагоцитов. Процесс обнаружения, поглощения и метаболизирования фрагментов погибшей клетки происходит сравнительно быстро. Это способствует избежать попадания содержания погибшей клетки в окружающую среду и тем самым, как отмечено выше, воспалительный процесс не развивается. Клетка уходит из жизни «спокойно», не беспокоя «соседей» («тихий суицид»).
Программированная клеточная гибель имеет важное значение для многих физиологических процессов . С апоптозом связаны:
поддержание нормальных процессов морфогенеза – запрограммированная смерть клеток в процессе эмбриогенеза (имплантации, органогенеза) и метаморфоза;
поддержание клеточного гомеостаза (в том числе ликвидация клеток с генетическими нарушениями и инфицированных вирусами). Апоптозом объясняется физиологическая инволюция и уравновешивание митозов в зрелых тканях и органах. Например, гибель клеток в активно пролиферирующих и самообновляющихся популяциях – эпителиоцитов кишечника, зрелых лейкоцитов, эритроцитов. Гормонально-зависимая инволюция – гибель эндометрия в конце менструального цикла;
селекция разновидностей клеток внутри популяции. Например, формирование антигенспецифической составляющей иммунной системы и управление реализацией ее эффекторных механизмов. С помощью апоптоза происходит выбраковка ненужных и опасных для организма клонов лимфоцитов (аутоагрессивных). Сравнительно недавно (Griffith T.S., 1997) показали значение программированной гибели клеток в защите «иммунологически привилегированных» зон (внутренние среды глаза и семенников). При прохождении гисто-гематических барьеров данных зон (что случается редко), эффекторные Т-лимфоциты гибнут (см. выше). Включение механизмов их смерти обеспечивается при взаимодействии Fas-лиганда барьерных клеток с Fas-рецепторами Т-лимфоцита, тем самым предотвращается развитие аутоагрессии.
Роль апоптоза в патологии и виды различных заболеваний связанных с нарушением апоптоза представлены в виде схемы (рис. 15) и таблицы 1.
Конечно, значение апоптоза в патологии меньше чем некроза (возможно, это связано с недостаточностью таких знаний). Однако, проблема его в патологии имеет и несколько иной характер: она оценивается по степени выраженности апоптоза — усиление или ослабление при тех или иных болезнях.
Биологическая клетка - это сложный и крайне интересный объект, по сути своей она является целым организмом, который рождается, дышит, питается, размножается и умирает. Но это не удивительно, ведь огромная часть живых существ на нашей планете состоят только из одной клетки. После поста об антиоксидантах и активных формах кислорода, мне захотелось написать про такой мрачный, но нужный процесс как запрограммированная смерть клеток - по научному апоптоз. Стоит отличать апоптоз от некроза, который является гибелью клеток в результате травмы и повреждения. Основное отличие - при апоптозе, которые не происходит случайно, из остатков клеток образуются апоптические тела, которые поедаются вызванными для этого фагоцитами, что препятствует воспалению и отравлению соседних клеток, а при некрозе происходит отмирание клеток и целых тканей, сопровождающееся сильным воспалением.
Интересный факт, что термин «апоптоз» означал опадание лепестков и листьев у растений, что, на мой взгляд, не совсем верно, так как при апоптозе остатки клетки утилизируются собственным организмом, а при опадании листьев они просто отваливаются и уже перерабатываются другими организмами. Хотя оба процесса носят запрограммированный характер. Но это всего лишь философско-лингвистические рассуждения.
Наши клетки - своеобразные ипохондрики и могут покончить с собой по любой причине: перегрев, радиационное облучение, гипоксия и многое другое. В целом клетки на столько склонны к самоубийству, что они все время получают сигнал от других клеток: «Живи-живи-живи» и прерывание этого сигнала сразу приводит к сильной депрессии с последующим намыливанием веревки апоптозу. Забавно, что из таких вот клеток складывается организм с весьма ощутимым инстинктом самосохранения… . Во истину, природа полна парадоксов.
Условно можно выделить три стадии апоптоза: инициация или получение сигнала, эффекторная стадия, в которой запускаются процессы деградации и, собственно, процесс разрушения и деградация - формирование апоптических тел с последующим поеданием макрофагами.
Выделяют 2 пути инициации: митохондриальный и внешний сигнал.
Митохондрии - энергетические станции нашего организма, там собственно и происходит процесс клеточного дыхания с превращением кислорода в воду. В школьных учебниках митохондрии изображались как такие вытянутые овалы разбросанные по всех клетке. Но это не совсем так. Если посмотреть на срез клетки, то вы действительно увидите такую картину, но при трехмерной реконструкции клеток по этим тонким срезам ученые обнаружили, что митохондирия в клетке всего одна, но она имеет сложную изогнутую структуру, поэтому на срезах мы видим различные ее выросты.
Митохондрии окружены двумя клеточными мембранами и между ними находятся белки апоптоза или апоптические белки, которые вырываются на свободу при разрыве внешней мембраны или формировании в ней пор. Собственно это и является ключевой фазой начала апоптоза. Освободившиеся белки через ряд биохимических реакций активируют каспазы - ферменты, которые разрушают другие белки. Каспазы начинаю крушить все вокруг себя, разрушая все основные клеточные структуры. В процессе разрушения митохондриальной мембраны не только высвобождаются белки, но и вода начинает активно поступать в митохондрию, вызывая ее разбухание.
Второй путь начала апоптоза - сигнальный. На поверхности клеток есть рецепторы клеточной гибели, специальные лиганды, продуцируемые другими клетками (частенько это бывают активированные макрофаги, которые позже и подъедают остатки), связываются с этими лигандами и активируют их. Рецепторы представляют собой большую молекулу, которая сидит в клеточной мембране и выступает с обоих сторон: внутрь клетки и наружу. С наружной стороны садится лиганд и по всему рецептору передается сигнал на внутреннюю сторону. Далее запускается цепь биохимических реакций, в результате которой, как и в митохондриальном пути, активируются каспазы.
На второй стадии апоптоза - эффекторной, уже не так важно как клетка получила сигнал. На этой стадии внутри начинается настоящий апокалипсис и главную роль в нем играют каспазы. Второй важный элемент этой стадии - флавопротеин AIF, который выходит из митохондрий и активируют эндонуклеазы - белки, которые разрушают ДНК клетки. Фактически, после этой стации клетка представляет собой город после ядерной бомбежки.
Во время разрушения митохондриальной мембраны также высвобождается весь энергетический комплекс, который провоцируют образование активных форм кислорода внутри клетки. Свободные радикалы запускают цепные реакции, которые способствуют разрушению содержимого клетки. В этот момент их уже нельзя сдержать антиоксидантами.
После этого начинается третья и последняя стадия - деградация. Клетка теряет свою форму и сжимается из-за разрушения клеточного скелета. Далее начинается фрагментация клетки на мелкие части, которые представляют собой клеточную мембрану с остатками внутри - эти образования получили название - апоптические тела. Вокруг умирающей клетки уже дежурят макрофаги, готовые набросится на останки. В процессе клетки, на поверхности мембраны появляются сигнальные белки, которые привлекают голодных макрофагов и вот, они уже поглощают останки погибшего сородича.
Пишу это, а сама думаю, что это все мне напоминает какую-то сцену из популярных ныне зомбо‑апокалипсисов. Прямо страшно стало. Один кровоподтек и на тебя набросятся и сожрут. Бр-р.
Но и у клеток есть антидепрессанты, которые держат эти процессы под контролем не давая среагировать на малейший стресс - это ингибиторы апоптических белков. Но, как только мембрана митохондрий начинает выпускать предшественников апокалипсиса, на волю вырывается и белок SMAC, который деактивируют эти ингибиторы и они становятся бесполезны. После этой стадии апоптоз уже сложно остановить.
Не стоит думать, что апоптоз - исключительно мрачно-негативное явление нашего организма. С помощью апоптоза поддерживается правильное количество и соотношение различных клеток в организме. Апоптоз играет далеко не последнюю роль в нашем развитии: например, разделение пальцев на руках и ногах является следствием запрогроммированной гибели клеток. При прорезании зубов у детей еще до того, как появится зуб начинается процесс гибели клеток десны, чтобы зубу было легко выйти. Хвост у головастиков также не отваливается с появлением ног, а деградирует с помощью того же явления.
Апоптоз незаменим при предотвращении развития раковых опухолей. Во время нашей обычной жизни огромное количество клеток в организме претерпевают патологические изменения и перерождаются в потенциально раковые клетки. Соседние клетки, как и бабушки на скамейки около подъезда, внимательно следят за своими соседями и при неадекватном поведении посылают клетке сигнал апоптоза еще до того, как она размножится и станет опасна. Собственно по этой причине за последние 20 лет сильно возрос интерес к апоптозу, как средству для предотвращения и борьбы со злокачественными опухолями.
Или уклонение от программированной клеточной смерти опухолевых клеток - важнейшее свойство злокачественного фенотипа.
В норме апоптозная программа присутствует в латентной форме во всех клетках организма, поскольку вполне очевидно, что в организме под влиянием различных факторов при прохождении клеткой клеточного цикла постоянно происходят повреждения ДНК, т.е. возникают мутации.
Известно, что в течение жизни в организме человека происходит 10 16 клеточных делений. Спонтанные мутации происходят с частотой - 10 6 на ген за клеточный цикл.
Таким образом, в течение жизни человека каждый ген вполне может подвергнуться мутированию около 10 миллиардов раз (10 16 х10 6 = 10 10), а ежедневно в организме происходит до 1 млн соматических мутаций.
И среди них, несомненно, возможны, ведущие к раку. С этих позиций проблема рака не столько в том, почему он возникает, а в том, почему он возникает так редко.
А возникает рак, несмотря на постоянное воздействие канцерогенных факторов, относительно редко потому, что в организме существуют механизмы защиты, направленные на сохранение нормального генотипа клетки. Необходимо отметить, что судьба клеток с теми или иными генетическими повреждениями может быть различной.
Часть мутированных клеток гибнет из-за витальных повреждений их генома, часть восстанавливается, часть организм уничтожает сам посредством апоптоза и, наконец, часть мутированных клеток выживет и в процессе размножения может стать источником накопления потенциально онкогенных мутаций и развития рака.
В норме генетический фонд клетки, несмотря на его хрупкость, защищен мощным ферментным аппаратом, часто обеспечивающим распознавании мутированных и измененных участков ДНК и их восстановление.
Репарация ДНК заключается в «вырезании» мутированных нуклеотидов с помощью эндо- и экзонуклеаз, синтеза нормального участка ДНК при участии ДНК-полимеразы и встраивании восстановленного участка в цепь ДНК под действием фермента лигазы. Тем самым воссоздается исходная генетически запрограммированная нуклеотидная последовательность поврежденной нити (рис. 3.12).
Рис 3.12. Схема репарации при повреждении ДНК и формирование мутации [Новик А.Л., 2004].
Если же активность репарационно-восстановительных систем недостаточна и повреждения в ДНК сохраняются, то в таких клетках индуцируется программируемая клеточная гибель, что приводит к уничтожению, в том числе и мутантных клеток, способных к злокачественной трансформации.
Апоптоз (от греч. apoptosis - опадание) - запрограммированная гибель клетки или «смерть клетки в результате самоуничтожения» - активный, генетически контролируемый процесс. Термин был предложен Kerr J. и соавт. (1972) для обозначения происходящих изменений в клетке во время ее физиологической гибели и ведущих к уменьшению числа клеток в противоположность митозу, обеспечивающему увеличение их числа.
Биологическое значение апоптоза
Биологическое значение апоптоза состоит в том, что это ключевой механизм поддержки генетического гомеостаза, который организм использует для удаления клеток, чье выживание нежелательно: чужеродных, дефектных с поломками в геноме; мутантных или зараженных вирусом; с неадекватной специфичностью рецепторов к различным регуляторам жизнедеятельности и т.д.В организме в каждую единицу времени миллионы клеток завершают свой цикл, отрабатывают «свой век». Для предотвращения «засорения» организма от успевших выполнить свою функцию «отработанных», «изношенных» клеток в ходе эволюции выработался специальный механизм их ликвидации - апоптоз.
Способность запускать самоликвидацию (апоптоз), является неотъемлемым свойством клеток для поддержания тканевого гомеостаза путем сохранения определенного баланса между пролиферацией (митозом) и гибелью.
Апоптоз играет исключительно важную роль в эмбриогенезе, в частности в регуляции количества мезодермальной ткани при формировании органов и скелета. В основе уничтожения иммунными клетками чужеродных также лежит апоптотический механизм.
Гибель клеток по типу апоптоза происходит при многих физиологических процессах: возрастной инволюции органов (тимус), атрофии (предстательной железы после кастрации), регрессии гиперплазии нормапьном функционировании яичников и семенников и, наконец, в уничтожении мутантных клеток.
Механизм активации апоптоза
Зрелые дифференцированные клетки в обычном состоянии устойчивы к индукции апоптоза, но становятся чувствительными к нему после своей активации. Такую активацию вызывают различные внешние воздействия через специфические рецепторы и внутриклеточные сигналы, вызванные экспрессией некоторых протоонкогенов.Они могут быть физиологическими - активация специальных киллерных цитокинов, изменения гормонального статуса (цикличное изменение эндометрия и др.), и нефизиологическими - внутриклеточные повреждения или неблагоприятные условия (нехватка факторов роста, повреждения ДНК, гипоксия и т.д.).
В механизмах активации апоптоза выделяют два основных этапа: фазу индукции (принятия решения) и фазу экзекуции (исполнения приговора). В первую фазу система сенсоров апоптоза отслеживает отклонения от нормы внутри- и внеклеточной среды и определяет дальнейшую судьбу клетки: жить ей или умереть.
Класс сенсоров представляет собой рецепторы клеточной поверхности, которые связывают сигналы выживания или смерти. В качестве таких сигналов выступают различные, цитокины.
При выявлении аномалий (например, повреждение ДНК, нехватка факторов роста, гипоксия и др.) посредством сенсорных регуляторов запускается вторая фаза апоптоза - исполнения приговора. Начинается она с активации каспаз + ферментов семейства цистеиновых протеиназ (так называемые казнящие каспазы).
Существует два принципиально разных пути активации каспаз. Один из них запускается в ответ на активный сигнал смерти, передаваемый специфическими киллерными цитокинами группы ФНО (фактор некроза опухолей) на соответствующие рецепторы (наиболее изучены Fas), называемые рецепторами смерти.
Апоптоз, вызванный активированными рецепторами смерти, называется инструктивным апоптозом. При втором пути активации каспаз ключевую роль играют митохондрии - митохондриальный апоптоз.
При этом различные повреждающие воздействия вызывают увеличение проницаемости мембраны митохондрий и выход в цитоплазму митохондриальны белков (в основном цитохрома С), которые через соответствующий каскад реакций и активируют каспазы.
Ключевую роль в регуляции проницаемости митохондриальной мембраны для цитохрома С играют белки семейства bcl-2, обладающие либо проапоптотическими, либо антиапоптотическими активностями.
Таким образом, в клетках человека в ответ на повреждения существует два механизма, запускающих апоптоз: инструктивный, вызываемый рецепторами смерти, и митохондриальный, обусловленный повышенной проницаемостью мембран. Между ними существует взаиморегуляция, что позволяет надежнее достигать конечного эффекта.
В итоге активированные тем или иным путем каспазы протеолитически расщепляют ключевые структурные компоненты клетки, что приводит к фрагментации ДНК и деструкции клетки. При этом цитоппазматический и ядерный скелеты разрушаются, хромосомы деградируют, ядро фрагментируется, но без разрыва клеточной мембраны.
Поэтому такая клетка может быть утилизирована фагоцитами и соседними клетками, и даже массовая их гибель не приводит к каким-либо патологическим процессам. Процесс протеолиза продолжается 30-120 минут, затем сморщенная клетка поглощается макрофагами и исчезает обычно в течение 24 часов (рис. 3.13).
Рис. 3.13. Фагоцитоз апоптотической клетки макрофагом [Фильченков А.А., Стойка Р.С., 1999]. 1 - фрагментированное ядро; 2 - фрагменты цитоплазмы (апоптотические тельца): 3 - фрагменты апоптотической клетки захвачены макрофагом.
Задачей апоптоза является утилизация фрагментов клетки пока ее содержимое не попало во внеклеточную среду и не вызвало воспалительного процесса. Внешние морфологические проявления апоптотической гибели клеток в виде кариопикноза (сморщивание ядра), кариорексиса (распад ядра на части), конденсации (сжатия) клетки и др. были известны давно и только в последнее время показано, что это частные проявления апоптоза. Вокруг клеток, подвергшихся апоптозу, воспалительный процесс не возникает.
Гибель клеток по типу апоптоза следует отличать от некроза - другой формы гибели клеток организма. Некроз инициируется нефизиологическими агентами, а апоптоз - и физиологическими, и нефизиологическими. В отличие от некроза, апоптоз встречается не только в патологически измененных, но и нормальных тканях.
Некроз происходит в случае, когда клетки подвергаются действию экстремальных факторов и поэтому его можно назвать патологической гибелью. При некрозе морфологические изменения как реакция на летальное повреждение клетки, почти всегда начинается с повреждения плазматической мембраны, что не бывает при апоптозе.
Из-за разрыва мембраны в клетку из внеклеточного пространства поступают молекулы воды и ионов и вызывают набухание структур. Одновременно попадание содержимого цитоплазмы (в том числе лизосомальных ферментов) во внеклеточное пространство вызывает повреждения тканей и развитие выраженного воспалительного процесса, что не происходит при апоптозе.
Кроме того, при апоптозе отмирают одиночные клетки, а при некрозе - их группы. Уничтожение клеток путем апоптоза по сравнению с некрозом обеспечивает минимальное повреждение тканей. Между этими процессами имеются и другие различия. На рисунке 3.14 схематически представлены две формы гибели клеток.
Рис. 3.14. Схематическое представление о двух формах гибели клеток [по Wyllle А. и соавт., 1998].
Как и другие физиологические процессы, апоптоз регулируется большим числом генов. Ключевая роль в запуске программы апоптоза принадлежит гену-cупpeccopy р53. Вследствие особой значимости р53 был назван геном XX века. р53 поддерживает стабильность генетического аппарата и осуществляет контроль над клеточным циклом.
В норме, при повреждениях структуры ДНК или других формах генотоксического стресса отмечается быстрая активация р53. Его белок блокирует клеточный цикл в фазе G1 до удвоения ДНК и митоза, инициирует и участвует в процессах репарации ДНК. Это позволяет клетке восстанавливать поврежденный участок ДНК, что предотвращает появление мутантных клеток.
При тяжелых неустранимых повреждениях р53 запускает программу апоптоза и тем самым предупреждает патологическую пролиферацию. Важно подчеркнуть, что р53-зависимый апоптоз элиминирует из организма не только поврежденные, но и те клетки, в которых наблюдается нерегулируемая стимуляция пролиферации.
Если р53 мутирует, он инактивируется и перестает запускать апоптозный каскад, что дает возможность сохраняться клеткам с поврежденной ДНК во время митоза, а это в свою очередь приводит к выживанию клеток, подвергшихся опухолевой трансформации (рис 3.15).
Рис. 3.15. Регулирующее влияние антионкогена р53 . Повреждение гена создает условия для патологической клеточной пролиферации.
Предполагается, что увеличение частоты неоплазии с возрастом связано не с накоплением мутаций в геноме клеток, а с возрастными нарушениями системы репарации ДНК.
Естественно, апоптоз рассматривается как мощная противоопухолевая защита. Угнетение процесса резко облегчает превращение нормальной клетки в раковую, так как в неспособных к апоптозу клетках легко будут накапливаться различные мутации.
Такие клетки-мутанты, несмотря на повреждения ДНК, будут продолжать активно размножаться. Накопление критического количества мутаций неизбежно приведет к появлению неоппастической клетки и формированию злокачественной опухоли (рис. 3.16).
Рис. 3.16. Нарушение процессов пролиферации (П) и апоптоза (А) клеток при онкогенезе [Фильченков А.А., Стойка Р.С., 1999].
Приобретенная резистентность к апоптозу является признаком большинства, если не всех опухолевых клонов. Уход от апоптоза резко повышает жизнеспособность неопластической клетки, делает ее менее чувствительной к факторам противоопухолевого иммунитета и терапевтическим воздействиям. Опухолевые клетки приобретают резистентность к апоптозу различными путями.
На сегодня установлено, что к ослаблению индукции апоптоза могут привести потеря экспрессии на поверхности клетки рецептора смерти Fas; нарушения проведения апоптогенного сигнала к митохондриям и ингибирование проницаемости митохондриальной мембраны для цитохрома С; блокирование активации и/или резкое уменьшение времени жизни казнящих каспаз.
Очевидно, наряду с белками, включающими апоптоз, есть белки, препятствующие ему, и между теми и другими существует тонкий баланс. Гены, способствующие апоптозу, относятся к генам-супрессорам (кроме р53, ВАХ, PML и др.). Гены, блокирующие работу этого защитного механизма - к протоонкогенам (BCL1, BCL2 и др.).
Последние при их активации нейтрализуют апоптозную активность и будут резко увеличивать появление постоянно пролиферирующих мутантных клеточных клонов, а, следовательно, и вероятность последующего развития из них злокачественных опухолей.
Считается, что соотношение количества различных форм онкобелков группы BCL и р53 определяет реостат жизни и смерти клетки. В связи с этим следует заметить, что вследствие существования механизма апоптоза принципиально невозможно достигнуть бессмертия организма.
С течением времени наступает атрофия клеток органов, регуляторов жизнедеятельности организма и развивается ряд заболеваний, которые объединяют общим названием -
